小学教师教研工作总结张富

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小学教师教研工作总结张富

小学教师教研工作总结

一期来，我兢兢业业，踏踏实实，根据期初的教学工作计划，以新课程改革为契机，以新课程标准的基本理念为指导，转变教学观念，有目的，有计划，有步骤地进行课程改革。本着科研先导，以研促教，教为学服务的研究宗旨，坚持不懈地抓住新课程改革这一契机，有条不紊的开展各项教学教研活动，顺利地完成了本学期的教育教研任务，实现了学期初制定的教学目标。为了更好地完成今后教育教研工作，使教学工作做到有的放矢，特对本学期的教研工作总结如下：

一、制订切实可行的教研计划

为了做好本期的教研工作，有的放矢，我们开学伊始，计划先行。我根据教育教学现状，认认真真地权衡利弊，制订出切实可行的教研计划。二、狠抓有效课堂教学

根据县教研室的要求和我班的教育教学现状，采取有效措施狠抓有效课堂教学。领会新大纲和新课程标准的精神实质把握教材的特点，制定出切实可行的教学工作计划。做到集体备课与独立备课相结合，高标准地完成单元备课和课时备课，及时对全册教材进行集体教研和教学方法的探讨，明确教学思路。积极参加各种教研活动，观摩学习，及时进行了教研探讨，并把学习到的教育新理念运用到自身的教学活动中，做到本校互听、校际交流、外出观摩，做到听课不少于20节。三开展活动促教学

为了全面提高素质教育，让教师和学生都有所发展，我积极参加各种教研活动。本期参加的教育教研活动主要有：校际教研交流活动、电化教学公开课、作文改革公开课、复习研讨课、语文青年教师比武课、有效课堂送下村、还举行了三年级学生语文知识综合竞赛、小学生读书活动演讲，从多方面开展素质教育。四、抓常规保质量

为尽可能地提高教育教学质量，我从教学计划到备课到上课到课后反思、批改作业、校本培训都进行了具体的实施。段考后对自己进行一次教学常规检查。

五、加强学习提高自身素质

学无止境，为自己能更好地为教育服务，展现教师的人生价值，我常常教导自己要有终身学习的观念，平时多读书看报，有机会多学习取经，鼓励自己

多写心得体会、教学所见所感、教育教学论文，不断地提高自身素质。

扩展阅读：12484040 张富

编号（学号）：12484040

毕业论文

（201*届本科）

题目：小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定及进化分析学院：生物科学技术学院专业：生物技术姓名：张富指导教师：郭志富完成日期：201*年06月08日

毕业论文任务书

论文题目学生姓名下发任务小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定及进化分析日期张富指导教师201*年6月郭志富一.论文主要内容根据已有小麦近缘属种重结晶抑制蛋白基因（IRI），设计引物，对小麦野生近缘属种山羊草、偃麦草、Thinopyrumpycnanthum等IRI基因进行克隆、测序鉴定以及不同种属的IRI基因进行彼此的差异化分析、进化分析，达到对IRI基因的全面的分析，为今后挑选抗冻性最强的IRI基因转移道小麦品种等作物中从而提高其抗冻性奠定理论基础。二.论文的基本要求1、学习掌握生物学文献的检索技能，查阅相关资料，撰写文献综述。2、掌握组培技术、DNA提取实验技术及NCBIBLAST的使用。3、熟练使用引物设计软件，操作PCR仪和连接、克隆、多序列分析。4、能够通过自己设计的实验，撰写毕业论文，不少于10000字。5、能熟练阅读与实验相关的中、英文文献。

三.论文工作进度安排阶段123456备注：四.应收集的资料及主要参考文献（指导教师指定）1.周筱娟.低温诱导的植物抗冻基因研究进展[J].绍兴文理学院学报.第24卷第9期201*年9月2.NovilloF。AlonmJM．ColdacclimationofArabidopaisthalLana：Affectonplasmamembranelipidcompositionandefreeze-inducedlesions[J]．PlantBiology，201*(11)139853990．3.SteponkusPLRoleofplamaamembraneincoldacclimationandfreezinginJuryInplants．Amlu.Rev[J]．PlantPhysi01．1984．35：543584．4.HughesMA，DunnMA．Themolecularbiologyofplantacclimationtolowtemperature．JExpBot，1996，47：29l8055.GibsonS，ArondelV．Cloningofatemperatureregulatedgeneencodingachloroplastω-3desaturasefromArabidopsisthaliana.PlantPhvsiol。1994，106：1615～162l6.Liansenliu,MichaeJ.White,ThornasH.MacRae.Eur.JBiochem.1999,262,247~2577.黄文功.殷奎德.高中超-植物抗冻基因工程研究进展生物技术通报，201*年第2期8.刘晓丹.李海燕-CBF转录因子在提高植物抗逆性中的作用.安徽农业科学。JournalofAnhuiAgri．5ci．201*．37{32}：1574915751论文各阶段名称阅读文献，查找相关资料实验所需材料的整理材料DNA提取PCR扩增及克隆测序处理数据、分析结果毕业论文成稿日期201*.06201*.06201*.06201*.06201*.12201*.01201*.05201*.05201*.

沈阳农业大学毕业论文选题审批表

选题名称学号小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定及进化分析姓名郭志富张富专业职称题目来源教师拟定（b）生物技术讲师12484040指导教师对偃麦草属、山羊草属、冰草、黑麦草属等小麦野生近缘属种材料提取DNA，利用研NCBI已有小麦属IRI蛋白基因同源引物克隆新的IRI基因，并连接到载体上，转化大肠究杆菌后进行阳性克隆筛选，测序后进行序列比对和进化分析。内容论文题目选定，资料查阅；准备实验材料及试剂药品；进行前期准备工作；研究提取材料DNA，进行PCR扩增并回收、克隆测序；计数据分析处理；划撰写论文。本实验在集中于发现多个小麦近缘属种中的IRI基因，并进行了不同品种间IRI基特因序列差异性分析和分子进化分析。为挑选、鉴定抗冻性最强的IRI基因的筛选以及后色续的转基因的工作奠定理论基础。指导教师意见教研室意见学院意见

毕业论文指导记录

学生姓名指导教师姓名论文题目时间学生签字：年月日指导教师签字：年月日教研室主任签字：年月日张富郭志富专业职称讲师生物技术本年度指导毕业生人数5小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定及进化分析地点指导内容

沈阳农业大学毕业论文考核表

论文题目：小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定及进化分析姓名：张富学号：12484040专业：生物技术指导教师评语：指导教师（签字）：年月日评阅人评审意见：评阅人（签字）：年月日答辩委员会意见：成绩：主任委员（签字）：年月日

摘要.............................................................................................................................................................1Abstract...........................................................................................................................................................2前言.............................................................................................................................................................31.IRI蛋白的研究概述...................................................................................................................................3

1.1抗冻蛋白（AFPs）的特性.............................................................................................................41.2植物AFPs发现...............................................................................................................................41.3植物IRI蛋白的理化性质及特征...................................................................................................41.4植物AFPs的结构模型特征...........................................................................................................51.5抗冻蛋白的作用机理......................................................................................................................61.6AFPs的研究意义和应用.................................................................................................................61.7植物AFPs的研究现状...................................................................................................................72.材料、试剂................................................................................................................................................9

2.1材料及处理......................................................................................................................................92.2菌株与载体......................................................................................................................................92.3酶与试剂.........................................................................................................................................92.4实验相关仪器及生物软件............................................................................................................102.5相关试剂的配制............................................................................................................................103.实验方法与步骤......................................................................................................................................12

3.1植物基因组DNA的提取（植物基因组DNA提取试剂盒）...................................................123.2IRI基因的PCR扩增.....................................................................................................................123.3目的片段与载体连接....................................................................................................................133.4转化................................................................................................................................................143.5阳性克隆：蓝白斑筛选................................................................................................................143.6菌落PCR.......................................................................................................................................143.7摇菌测序........................................................................................................................................154．实验结果与分析.....................................................................................................................................15

4.1PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测....................................................................................................154.2测序结果及分析............................................................................................................................164.3测序结果的DNA多序列比多和氨基酸序列比对分析..............................................................174.4IRI的进化分析...............................................................................................................................205．讨论.....................................................................................................................................................23参考文献.......................................................................................................................................................25致谢.........................................................................................................................................................27

":null,"page":{"ph":1262.879,"pw":892.979,"v":6,"t":"1","pptlike":null,"cx":0,"cy":0,"cw":892.979,"ch":1262.879}})沈阳农业大学学士学位论文

摘要

小麦野生近缘属种中蕴含丰富的抗性资源，是小麦遗传改良的天然基因库。重结晶抑制蛋白(IceRecrystallizationInhibitionprotein，IRI)能结合于冰晶表面阻止冰晶生长，从而提高植物抗寒能力。在小麦野生近缘属种中广泛分离IRI基因，并对其进行功能分析，对后续筛选优势IRI基因转入到小麦等作物品种从而提高抗寒力具有重要意义。本文主要研究结果如下：

(1)在5个小麦野生近缘属材料中，克隆得到编号为B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21共8个序列具有典型IRI基因的保守区特征，同时在氨基酸组成上存在一定的结构差异。(2)在所得IRI基因中，DNA序列最短的为849bp，最长为864bp，其中B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25编码的氨基酸总数分别为287、283、286、288、284、285、288、284。(3)B24和W25基因末端由于碱基的缺失，导致移码突变，使得后续氨基酸突变，该突变可能引起IRI蛋白的功能的改变。

(4)B25基因编码的半胱氨酸只有3个，为奇数个，而其余的7个基因编码的半胱氨酸均为4个，是偶数个。该氨基酸的突变是由于单碱基置换引起的，推测可能会影响IRI蛋白的功能。

(5)进化分析表明，不同材料中克隆出的IRI基因亲缘关系可能比同一材料中的更近，说明IRI基因家族存在较为丰富的变异，推测可能是在植物长期进化过程中不断适应低温变化而调整自身基因结构从而适应低温环境的原因。

关键词：重结晶抑制蛋白；低温；抗冻蛋白；小麦野生近缘属种；克隆；进化分析

小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定以及纯化

Abstract

Thewildrelativesofwheatarespeciescontainsrichresourcesofresistanceisthenaturalgenepoolforwheatimprovement.Recrystallizationinhibitionprotein(IceRecrystallizationInhibitionprotein,IRI)cancombinetopreventthegrowthoficecrystalsintheicesurface,therebyimprovingplantcoldtolerance.IRIgeneinthewildrelativesofwheatspecieswidelyseparated,andfunctionalanalysis,andfollow-upscreeningadvantageIRIgeneintothewheat,andothercropvarieties,therebyenhancingthecoldhardinessofgreatsignificance.

Inthispaper,resultsareasfollows:

(1)infivewildrelativesofwheatmetallicmaterials,theclonednumberB2A,B2B,B15C,B24,B25,W15,W17,W218sequencestypicalIRIgenesconservedregioncharacteristics,whileintheaminoacidcompositiontherearesomestructuraldifferences.

(2)theproceedsofIRIgenes,DNAsequencesaretheshortest849bp,upto864bp,ofwhichthetotalnumberofB2A,B2B,B15C,B24,B25,W15,W17,W25-encodedaminoacidswere287,283,286,288,284,285,288,284.

(3)theendoftheB24andW25genebasedeletion,resultinginframeshiftmutation,makingthesubsequentaminoacidmutations,themutationsmaycausefunctionalchangesofIRIprotein.

(4)B25geneencodingthecysteine3isanoddnumber,whiletheremainingsevengenesencodingcysteineare4,isanevennumber.Theaminoacidmutationsarecausedbysinglebasesubstitutions,suggestingthatmayaffectthefunctionoftheIRIprotein.

(5)ThephylogeneticanalysisshowedthatclonedindifferentmaterialsIRIgenephylogeneticrelationshipmaybecloserthaninthesamematerial,indicatingthattheIRIgenefamilythereismorevariation,andspeculatedthatitmightcontinueinthelong-termevolutionaryprocessofplantadaptationtolowtemperaturechangesadjustitsgenestructuretoadapttothereasonsofthelow-temperatureenvironment.

沈阳农业大学学士学位论文

前言

植物在为了适应环境而进化出不同的抗性条件。植物生长发育过程中，温度作为一个重要的环境因子对其生长、生殖和分布起着关键的作用。温度的不同导致植物在不同地区分布不同的主要原因之一，低温不仅在很大程度上限制植物的种植范围，同时还会造成减产和品质下降，严重时甚至绝收。根据植物对低温的反应差异，可以将植物简要分为两类：一类是耐寒能力弱或不能耐寒的植物，也称冷敏感植物；另一类是抗寒植物，也称冷不敏感植物。不抗寒植物主要分布于热带和亚热带地区，10～12℃的非冰冻低温即可引起对植物生命活动的伤害，而抗寒植物生长于温带、寒带地区，在长期的进化过程中形成了低温相应的抵抗能力，但在不同植物之间抗寒能力强弱上存在差异[1，2]。

就小麦这一品种作物而言，生长在我国南方的小麦和生长在我国北方的小麦表现了不同差异。南方的小麦处于温和的地区，没有低温寒害的环境，小麦存活而产量高。相比较而言，北方的小麦耐寒的能力相对较强，但是依旧会面着骤降低温寒害。但是，由于南方的小麦不具抗寒能力，将南方的小麦移植到北方从而提高北方小麦的产量的想法却没有成功，此外，北方的的小麦的抗寒能力也有限。小麦是全球种植总产量第二的粮食作物，仅次于玉米，每年因为低温寒害而造成的小麦损失达数千亿美元，所以提高小麦的抗寒能力尤为重要。所以，通过研究小麦野生近缘属种植物中抗寒能力最强的植物，将其对抗寒能力起着重要作用的的相关基因克隆出来，通过转基因技术转移到小麦等相关的作物中提高作物的抗寒能力，免受或降低低温的损害从而提高小麦的产量相当重要。

在长期的进化过程中，植物形成的抗冻蛋白具有抗冻、抗病双重功能。植物抗冻蛋白提高植物抗冻性的主要途径不是阻止冰晶的形成，而是调控胞外冰晶的增长及抑制冰的重结晶，避免冰晶增大而产生致死性的机械损伤[3,4]．IRI蛋白是具有重结晶抑制活性的AFP蛋白，主要分布于南北回归线以外高纬度地区以及高山高寒区，常见的有高山雪莲、胡萝卜[5]、黑麦草[6]、沙生冰草[7]、沙冬青[8]等，它们共同的特点是都经过冷诱导，IRI蛋白表达从而提高植物的抗寒性。

1.IRI蛋白的研究概述

抗冻蛋白(antifreezeproteins，AFPs)是1969年Devrjes在南极Mcmurdo海峡的一种Nototheniid鱼的血液中首次发现的，它是生物体在受冻害胁迫时产生并籍此防止细胞免受冰冻伤害．AFPs已经在多种冰冻耐受机体中发现，包括鱼类、昆虫、陆生节肢动物、细菌、真菌和植物．其中，有关植物AFPs的研究起步较晚，20世纪90年代初

小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定以及纯化

期才开始研究植物中的AFPs．近年来，AFPs的研究已取得重大进展，成为生命科学中较为活跃而且发展迅速的课题之一．

1.1抗冻蛋白（AFPs）的特性

抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋白质，它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，于是导致水溶液的熔点(meltingpoint，MP)和冰点(freezingpoint，FP)之间出现差值，这种差值称为热滞活性(thermalhysteresisactivity，THA)，因而抗冻蛋白亦称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白(thermalhysteresisproteins，THPs)。AFPs从发现至今，有两个特性，其中之一是产生热滞效应．一般溶液(如Nacl，蔗糖溶液等)的冰点是固、液两相蒸气压平衡时的温度，因而冰点应等于熔点．但是AFPs这类大分子只影响结冰过程，几乎不影响熔化过程，使冰点低于熔点，这种现象叫做热滞效应．热滞是一种非理想溶液的行为，AFPs的冰点不由溶液的依数性决定，而它的熔点却由溶液的依数性决定，使二者出现差值，冰点和熔点的差值称为热滞值[10]．AFPs的另一个特性是抑制冰晶的重结晶，AFPs通过抑制冰晶的重晶化，防止小的冰晶结成更大的冰晶，使形成的冰晶小且均匀．因此，它可以减轻冰晶在冻融的动态变化中对生物体的伤害．AFPs的上述特性都是通过AFPs与冰晶的表面相互作用而实现的。以上两个特性可作为判定AFPs的依据。

[9]

1.2植物AFPs发现

Griffithetal.[11]1992年第一次明确提出已经获得植物植物内源AFPs，从经低温有道忍受细胞外结冰的冬黑麦(SecalecerealeL．)叶片质外体中得到并部分纯化了该蛋白，Dumanetal．[12]多种植物中发现了具有热滞效应的蛋白质，并从千年不烂心(Solanumdulcamara)的冬季枝条中分离到分子量为67kD的抗冻糖蛋白[13]。1994年，费云标等[14]从强抗冻植物沙冬青(Ammopiptanthusmonglicus)叶片中发现AFPs,随后，越来越多的抗冻蛋白相继被发现。

1.3植物IRI蛋白的理化性质及特征

Griffithetal.[11]于1992年从冬黑麦(SecalecerealeL．)的质外体中分离和纯化了AFPs的研究表明冬黑麦的AFPs包括7个AFPs(分子量从1l～36kD)，这些蛋白存在着彼此的相似氨基酸组成，均富含Asp／Asn，Glu／Gln，ser，Thr，Gly，Ala，均缺少His，Cys含量达5％以上．而且Western印迹分析表明，植物冬黑麦的AFPs同鱼及昆虫富含Cys的AFPs没有共同的抗原决定簇．1994年费云标等[14]从强抗冻植物沙

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冬青(Ammopiptanthsumongolicus）中发现AFPs，接着他们从沙冬青叶片中分理出AFPs，其中一种为热稳定的抗冻糖蛋白AFPs，分子量为40kD，热滞活性为0．9℃(20mgmL-1)，和其它AFPs进行比较，没有发现相同的类型，测定其N一端20个氨基酸为SDDLLFNKFVPCQTDILF，表明它与植物凝集素具有同源性[15]．另外3种不是糖蛋白，它们分别为：分子量67kD，热滞活性O．46℃(8mgmL-1)，分子量2lkD．热滞活性0。46℃(8mgmL-1)分子量39．8kD．热滞活性0．45℃(10mgmL-1)[16]．Sidebottometal[17]从一种越冬的多年生黑麦草(Loliumperenne)中发现了一种热稳定性的AFPs，这种蛋白由118个氨基酸组成，100℃时仍稳定存在，热滞效相对较低，但对球晶重结晶抑制效应是鱼的AFPs(TypⅢ)的200倍．因此，在低温条件下，推测冬麦草AFPs的重结晶抑制效应可能是细胞避免冰冻损伤的重要生理基础．

综合已经发现的植物AFPs，发现具有以下特点：

(1)不同植物的AFPs的蛋白质结构上差别很大，表现在氨基酸序列相似性低。虽然其在DNA和氨基酸水平上完全不同(几乎没有同源性)但却拥有相似的高级结构，冰晶结合位点也有一定的相似性。而且都可以通过表面互补模型较好地解释它们与冰晶之间的相互作用,但植物的AFPs表面互补模型也存在很多问题(如至今还无法确定表面互补模型中到底含有多少种作用力的存在），每种作用力的贡献程度和作用方式更是需要进一步的研究[18，19]。现在一般认为范德华力和疏水作用可能起着主要的作用，氢键起着辅助的作用。

(2)已经发现的植物AFPs不仅仅只具有抗冻活性，还存在酶功能(如已经发现的内切几丁质酶[18]，内切β-1，3葡聚糖酶)，抗菌功能(如甜味蛋白等)和抗虫功能(植物凝集素)，抗旱功能(植物脱水素)等活性；

(3)总体上已发现的大部分植物AFPs的热滞活性都大大低于鱼类和昆虫AFPs的热滞活性，但也有例外，有些植物(如黑麦草)的AFPs的冰晶重结晶抑制效应远远大于鱼类和昆虫AFPs，表明了植物AFPs存在的多样性。所以，推测植物AFPs提高本身的抗冻性的主要途径不是通过阻止冰晶形成，而是通过控制冰晶增长和抑制冰晶重结晶效应；

(4)植物的AFPs表达除了被低温诱导外，还能被其它外因影响，如干旱[19]，外源乙烯

[20]

(可诱导冬黑麦的AFPs)，脱落酸

[21]

等也可诱导植物AFPs的产生。推测植物的AFPs

可能还有其它方面的功能。

1.4植物AFPs的结构模型特征

由于最初发现的AFPs来自鱼类，所以有关鱼类AFPs的结构模型的研究较多，但是与植物相关的的AFPs研究相对较晚，而且植物的AFPs存在较大的差异性，所以植物相关的AFPs研究较少。201*年Kuiperetal.[22]在研究多年生黑麦草的AFPs的中发现

小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定以及纯化

其抑制活性高，热滞活性低，而且其一级结构中含有重复性的序列。他们从理论提出了一种三维结构模型：在获得的包含个118个氨基酸的AFPs的多肽中，每14～15个氨基酸组成一个环，8个这样的环组成一个β-筒状结构，β-筒状结构的一端是保守的缬氨酸疏水核，另一端是由内部天冬酰氨组成的梯状结构。已知缬氨酸是疏水性氨基酸，天冬酰氨是亲水性氨基酸；β-筒状结构的亲水端与冰晶表面吻合互补，疏水端则有效地防止了水与冰晶的结合，阻止了冰晶继续生长。这个模型很好地解释了植物AFPs热滞活性低、冰重结晶抑制活性高的现象。

1.5抗冻蛋白的作用机理

（1）热滞效应。大量研究发现抗冻蛋白降低溶液冰点的效率比一般溶质要高。在较低浓度下，抗冻蛋白降低溶液冰点的效应随其浓度增加而增强，在较高浓度下，这种效应逐渐趋于饱和。抗冻蛋白的效应可与NaCl等溶质的效应相加而共同使冰点大幅度降低，以非依数性形式降低水溶液的冰点，对熔点影响很小，所以导致水溶液的熔点和冰点出现差值。这种现象叫做热滞效应，因而抗冻蛋白也被称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白[23]。

（2）冰晶形态效应。抗冻蛋白能抑制冰晶生长，而且这种抑制作用在不同的方向上有强弱之分，进而引起冰晶形态的改变。冰通常以平行于晶格基面(a轴)的方式生长，在垂直基面(c轴)很少生长，因此冰晶格呈扁圆状。低浓度的抗冻蛋白优先抑制冰沿a轴生长，因此冰晶格的六边柱表面变得明显。而在高浓度的抗冻蛋白下，冰晶格主要沿c轴生长，形成六边双棱锥及针形晶体。有研究者认为，抗冻蛋白的这种作用，可以在生物体内调节胞外冰晶的生长形态，以尽量避免冰晶对细胞膜造成机械损伤[24]。（3）抑制冰晶的重结晶。重结晶是指在已经形成的晶体颗粒之间进行生长重分配，大的愈大，小的愈小。这种情况多发生在温度波动之时，往往对植物体细胞造成致命伤害。而抗冻蛋白具有抑制重结晶的作用，所形成的晶体体积小而比较均匀。抑制冰的重结晶对于某些生物特别是耐冻生物具有更重要的意义，而且引人注意的就是重晶化的抑制作用比冰晶生长的抑制作用更容易达到，即只需要少量抗冻蛋白(20μgmL-1)，就有较高的重结晶抑制活性

[25]

。

所以，通过克隆出能被冷诱导表达的IRI基因，通过转基因手段转移到到所需作物中，诱导IRI基因的表达从而提高作物的抗冻能力。

1.6AFPs的研究意义和应用

植物抗冰冻存在着多种机制，抗冻蛋白的发现和研究揭示了植物抵御低温的又一途径，为我们了解植物的抗冻作用原理提供了新的思路，同时也为生产实践提供了理论依

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据。

农业上，从1998年，worralletal[26]从胡萝中发现第一个植物AFPs基因后，获得其cDNA并将其连接道表达载体的双CAMV35s启动子之后导人烟草，让其组成性表达，对其进行抗冻功能验证。此外，还用蛋白质免疫杂交法进行检测，发现了AFPs在烟草已表达。同时，将这些表达的AFPs进行提取，发现含有胡萝卜AFPs的烟草提取物可以抑制冰晶的生长。由于植物内源AFPs基因更适合在植物体内表达，由此产生的转基因植物在抗寒冻性改变将会更明显。该实验成果为后续将抗冻性强的植物中的AFPs蛋白通过转基因技术转移到小麦、玉米、水稻等作物或是植物奠定了理论基础与实验技术方案基础，使农作物提高自身的抗冻性进而提高粮食产量。

医药上主要将AFPs用于细胞、器官的超低温保存。研究表明，AFPs可用于人和动物的卵、精子、胚胎或肝脏等器官的超低温保存，从而改善其冷冻质量[27]。此外，由于植物AFPs的多样性，某些植物的AFPs冰晶重结晶抑制效应比动物AFPs大的多，所以植物AFPs在医学上所起的作用将会更大。

由于AFPs在食品的冰冻、储藏、运输和解冻等过程中均能抑制重结晶化，并能减少滴液以防止营养成分的损失[28]．食品上，植物AFPs已经应用于冷冻食品业如：冰淇淋[29]的制造和保存，冷冻肉[30]的保存等等。

1.7植物AFPs的研究现状

植物体内AFPs的形成是比较复杂的过程，温度的降低是形成AFPs的主要因素。温度控制抗冻基因的表达，AFPs与植物的抗性密切联系。相对于动物蛋白而言，的研究植物AFPs的研究起步较晚，虽然已被研究的植物材料达40余种，但真正被分离并被转基因功能验证的AFPs并不多。目前，主要对以下植物的AFPs进行了研究：冬黑麦、千年不烂心、沙冬青、无头甘蓝、胡萝、桃树、冬小麦、黑麦草、唐古红景天、珠芽蓼[31-33]。在小麦族中抗冻蛋白被称为重结晶抑制蛋白（IceRecrystallisationInhibition，IRI）或IAPs(Ice-activeproteins)。Sandve[34]从黑麦草和大麦中分离了15个IRI蛋白基因，并与水稻、拟南芥等相应同源基因进行了分子进化分析。Krishnanand[15]从黑麦草中分离了5个IAPs基因，比较结果表明其均具有IRI类似基因的典型结构特征，同时存在一定的差异。对其中3个基因进行体外表达和功能分析发现，IAPs均具有抑制重结晶的活性。Tremblay[36]等从冬小麦中分离了2个IRI蛋白基因TaIRI1和TaIRI2，并对两个基因进行了体外表达分析，但对于IRI蛋白基因的功能分析及遗传转化未做详细研究，限制了对IRI基因功能和表达调控机制的全面了解。

本研究以小麦野生近缘属种尾状山羊草、彭梯卡仑麦草、支药大麦草、布顿大麦草、沙生冰草为研究材料，对小麦野生近缘属种IRI基因基因进行分离和鉴定，克隆其编码区，并对所克隆IRI基因进行进化分析，即小麦野生近缘属种IRI基因之间彼此在碱基

小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定以及纯化

排列、氨基酸、重复区的等的共同性与差异性。这些将为阐明小麦低温胁迫过程中IRI基因表达调控机理以及更详尽的揭示小麦抗寒分子机制提供重要参考，同时为发掘新型抗寒基因和通过转基因技术提高小麦的抗寒力奠定理论基础。

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2.材料、试剂

2.1材料及处理

供试材料：尾状山羊草、彭梯卡仑麦草、支药大麦草、布顿大麦草、沙生冰草等小麦近缘属种编号为B1-B25(25个品种)、W1-W15（15个品种）201*系列（201*-1,201*-4,201*-7三个品种）、PI（37个品种）和W6（8个品种）系列开头。在90个品种中，种质资源B1-B25、W1-W15和201*系列来源于中国农科院、PI和W6由美国种子资源中心提供。

材料处理：挑选籽粒饱满的小麦野生近缘属种材料种子，将其表面用75%的酒精消毒，然后将种子放在垫有湿润滤纸的培养皿上，置于25℃恒温培养箱中发芽，保持种子充分湿润。待幼苗生长7-14d左右种子长出幼苗后，选取绿色嫩叶进行DNA提取。

2.2菌株与载体

试验所用大肠杆菌菌株E.coliTop10购于天根生化科技（北京）有限公司。质粒载体pGM-T购自TaKaRa公司。

2.3酶与试剂

新型植物基因组DNA提取试剂盒、DL201*DNAmarker、T4DNA连接酶、pGM-T载、Taq酶购于天根生化科技（北京）有限公司，IPTG，X-Gal，琼脂糖凝胶回收试剂盒购于XYGEN公司，引物由赛百盛公司合成，测序由北京天根公司、上海生工完成；其余试剂为国产分析纯，取自沈阳农业大学国资处，低熔点琼脂糖为Sigma公司产品。

液氮纯度为99.999，由沈阳特种气体厂提供。

实验所用引物：

IRI-F：5-ATGGCGAAATGC(G/T)GGCTG-3IRI-F新：5-ATGGCGCC(A/G)AAATGCTGGCT-3

IRI-R1：5-ATTGTGAGCTACACTGAACTTGGACA-3IRI-R2：5-TCATTCATCTCCTACGACTTTGTT-3IRI22-R：5-CCAAGCTTTCATTCATCTCCTGTT-3IRIR1新：5-GATTGTGAGCTACACTGAACTTGG-3IRIR2新：5-TCATTCATCTCCTACGACTTTGTT-3IRIR3新：5-TTAACCTCC(T/C)GTCACGACTTTGTT-3

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其中引物组合为：IRI-F和IRI-R1、IRI-F和IRI-R2、IRI-F和IRI22-R、IRI-F和IRIR1新、IRI-F和IRIR2新、IRI-F和IRIR3新；IRI-F新和IRIR1新、IRI-F新和IRIR2、IRI-F新和IRIR3新。

由于要克隆的IRI基因多样性，在根据NCBI数据库中已有的IRI基因数据，用primer设计引物克隆小麦近缘属种中IRI基因时，发现即使在同源区段也存在一个或多个碱基的不同，所以设计了兼并引物的同时也设计了多对引物。本课题研究的是克隆多个与小麦亲缘关系较近的植物属种的IRI基因，数据量以及信息较多，所以利用多对引物对实验材料进行广泛的IRI基因筛选。

2.4实验相关仪器及生物软件

主要仪器：BIO-RADPTC-200型PCR仪；BIO-RAD凝胶成像仪；DYY-8B稳压稳流电泳仪；超纯水仪(PALLPL5243)；HERMLEZ233MK-2台式微量冷冻离心机；HITACHISCR20BA高速冷冻离心机；HH-6恒温水浴锅；MP200A分析天平；Eppendorf移液器2.5ul、10ul、100ul、1000ul；超净工作台。

相关生物学软件及网站：引物设计软件Primer5.0，序列分析软件DNAMAN，MEGA3.0，NCBIBlast：。

2.5相关试剂的配制

液体LB培养基（1L）：

细菌培养用胰化蛋白胨10.0g细菌培养用酵母提取物5.0gNaCl10.0g

固体LB培养基（1L）：

细菌培养用胰化蛋白胨10.0g细菌培养用酵母提取物5.0gNaCl10.0g琼脂15.0g

在950mL去离子水中加入以上各溶质，充分搅拌溶解，滴加5molL-1NaOH（约0.2mL）调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L（固体培养基每L加15g琼脂粉），121℃高压蒸汽灭菌20min。

100mgmL-1氨苄青霉素（Amp）贮液：称取100mgAmp溶于1mLddH2O中，

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用0.22m滤器过滤除菌，-20℃保存。

0.1molmL-1IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）：称取2gIPTG溶于8mLddH2O中，充分混合溶解后定容至10mL，用0.22m滤膜过滤除菌，每份1mL，-20℃保存。

20mgmL-1X-Gal（5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷）：称取1gX-Gal置于50mL离心管中，加入40mLDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后定容至50mL，每份1mL，-20℃避光保存。

10gmL-1EB溶液（溴乙锭）：1mg溴乙锭加入100mL去离子水中，充分溶解后转移至棕色瓶中，室温避光保存。工作时稀释到0.5gmL-1。

10×TBEBuffer（pH8.3）：Tris108gNa2EDTA2H2O7.44g硼酸55g定容至1000mL，室温保存。

上样缓冲液（6×）：称取溴酚蓝250mg，加重蒸水10mL，室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖40g，加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，混匀后加重蒸水定容至100ml。

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3.实验方法与步骤

3.1植物基因组DNA的提取（植物基因组DNA提取试剂盒）

1）取植物新鲜组织100mg或干重20mg，加液氮充分研磨。用小勺取适当研磨碎屑于1.5ml或2.0ml离心管中，离心管中已加入400ml缓冲液LP1和6LRNaseA（10mg/L），漩涡震荡1min静置10min（室温）。

2）加入130ml缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1min。3）1201*r/min离心5min，将上清液移至新离心管。

4）加入1.5倍体积缓冲液LP3立即充分混匀15s，可能会有絮状沉淀。

5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），1201*r/min离心30s，倒废液，吸附柱CB3放入收集管中。注：因步骤4中总体积=750+500=1250L，而吸附柱最大容积为700L。故步骤5分为两小步：（1）.先吸取700L液加入到吸附柱CB3，1201*r/min离心30s，倒废液。（2）.再吸剩余550L液加入到吸附柱CB3重复一次。

6）向吸附柱CB3中加700ml漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），1201*r/min离心30s。倒废液，将吸附柱CB3放回收集管中。注：若吸附柱膜呈绿色，向吸附柱CB3中加500L无水乙醇，1201*r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7）向吸附柱CB3中加入500L漂洗液PW，1201*r/min离心30s，倒掉废液。

8）将吸附柱CB3放回收集管中，1201*r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3放置室温数分钟（5-6min）以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。注：这一步目的是去除吸附柱中残余的漂洗液，漂洗液中乙醇的残余会影响后续酶反应实验。

9）将吸附柱CB3转入一个干净离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200L洗脱缓冲液TE，室温静置2-5min，1201*r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。注：为增加基因组DNA得率，可将离心溶液再加入吸附柱CB3中室温静置2min。

3.2IRI基因的PCR扩增

PCR体系：下述溶液、试剂按顺序添加

ddH201*.6l

10×TaqPCR缓冲液2.5ldNTPs0.4l引物F1.0l引物R1.0l

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模板DNA2l

Taq酶（Tiangen）0.5l注：引物F指代IRI-F、IRI-F新

引物R指代IRI-R1、IRI-R2、IRI22-R、IRIR1新、IRIR2新、IRIR3新

总体积：25l。

PCR程序：

94°C5min

94°C30s50-60°C45s72°C1min72°C7min16°C10min

将PCR程序扩增后的PCR产物与溴酚蓝或6*loadingbuffer或10*loadingbuffer上样缓冲液混匀，点入电泳槽的琼脂糖凝胶孔槽中。

注：退火温度为50-60°C表示由于引物组合不同，PCR反应最适合的退货温度不同。实验中所用的引物对应PCR的最适合温度采用的是梯度PCR筛选的，即退货温度50-60°C进行筛选的。

35个循环

3.3目的片段与载体连接

连接体系（连接试剂盒由天根生化科技公司提供）

目的PCR片段7lPGM-T载体1l连接酶缓冲液1lT4DNA连接酶1l反应体系总体积：10l

上述溶液按顺序分别加入200l的PCR管中后，混合液轻轻震荡后顺势离心，置于16℃链接反应10-12h。连接后的产物直接用来转化或者置于4℃冰箱保存备用（连接产物不稳定，连接过后产物所处的温度越高连接的效果降低越快，若保存2-3天需置于-20℃冰箱）。

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3.4转化

1）将恒温水浴锅温度调至42℃。

2）取5l重组DNA混合液加入100l感受态细胞中，轻轻震荡后置于冰上30min。3）轻轻摇匀后放置冰上，42℃水浴锅中热击90S，然后迅速放回冰中，静置3-5min。4）在超净工作台上向管中加入500l预热至37℃的LB液体培养基（不含抗生素），轻轻混匀然后固定到摇床的弹簧架上，37℃低速震荡1h。

5）将含50mlLB固体培养基放入微波炉熔化后放置于超净工作台，待LB固体培养基冷却至60℃左右（不烫手时）时加入25l100mg/ml的Amp，混匀后分装于2个平板培养皿中。待LB固体培养基室温冷却凝固后再用。

6）取出步骤4）中菌液，5000-7000转离心5min，用移液器吸掉200l上清液，把离心管中剩余的上清液和离心管底部菌液混匀。

7）在超净工作台上取上述转化的菌液100-300l，滴到LB平板培养皿（含50g/ml的Amp）中，再在平板上滴加40l20mg/ml的x-gal，10l0.1mol/l的IPTG，用烧过的玻璃棒冷却后涂布均匀。

8）在涂好的培养皿上做好标记，先正放置在37℃恒温培养箱中30min，待培养基表面的液体都渗入培养基后，倒置培养皿，37℃恒温培养箱过夜（12-16h），出现菌落。

3.5阳性克隆：蓝白斑筛选

经过过夜培养，培养板上生长出蓝白斑，蓝斑为T载体自身连接形成的空质粒，白斑为目的基因与T载体连接形成的环形质粒。筛选出白斑，用消过毒的牙签或接种针挑取单个菌落，于平板LB固体培养基上划线，过夜培养（12-16h）。

3.6菌落PCR

ddH201*.6l

10×TaqPCR缓冲液2.5ldNTPs0.4l引物F1.0l引物R1.0l

模板DNA2l

Taq酶（Tiangen）0.5l程序同之前的PCR一样。

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3.7摇菌测序

1)取1.5ml离心管，加入1mlLB液体培养基，再加入1l100mg/ml的Amp并编号。2）选取之前菌落PCR出现目的片段的单菌落，用灭过菌的牙签或枪头挑菌到LB液体培养基的离心管中，混匀。封盖，并用封口膜封住离心管盖边缘防止杂菌污染。3）置于37℃水浴或空气浴摇床，180r/min过夜培养12-16小时。4）送至测序公司测序。

4．实验结果与分析

4.1PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

201*bp1000bp750bp500bp250bp100bpB15B19B25图4.1

B2marker

根据primer引物设计软件设计的引物，对小麦近缘属种进行IRI克隆的片段的大小应该在700-1000bp左右。图中的B2为单一的亮带，而B25、B19、B15出现了多条带，主要由于IRI基因是一个多基因家族，所以在用PCR过程中，同一对引物的PCR可能同时两条或多个片段在700-1000bp的条带，由于对这些条带的序列未知，所以这些片段都进行回收做后续连接、转化、测序，以确定是否为IRI基因。图中还出出现了在700-1000bp外出现了其它片段和同一品种间条带亮度不一（如B25三个孔槽中只有退火温度不同，导致了条带亮度不同），这样的原因是由于实验所用的引物为通用引物，而

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且PCR程序在筛选最适的退火温度中用了梯度温度。图中700-1000bp有条带而且清晰，确保了可以做切胶回收，做后续步骤。

4.2测序结果及分析

表4.1

通过用9对引物（IRI-F和IRI-R1、IRI-F和IRI-R2、IRI-F和IRI22-R、IRI-F和IRIR1新、IRI-F和IRIR2新、IRI-F和IRIR3新；IRI-F新和IRIR1新、IRI-F新和IRIR2、IRI-F新和IRIR3新），对小麦野生近缘属种编号为B1-B25、W1-W15、W1-W15（15个品种）、Pi和W6系列进行IRI基因克隆。

在供试材料90个品种中，许多小麦野生近缘属种的植物种子萌发过程实验中从未发芽，没有绿叶。其次在种子萌发成幼苗的品种提取DNA后进行IRI基因的PCR扩增,许多也出现没有扩增条带，或者是扩增出的条带不在预计700-1000bp范围内。最终能通过PCR得到700-1000bp片段的品种列举在表4.1中。

表4.1列举了所用引物组合的PCR反应能扩增出700-1000bp左右的片段。在扩增的片段中，有的能扩增出一条在700-1000bp条带，而有的能在700-1000bp间扩增出多条片段，如W22-W25能扩增4条片段。通过测序发现，即使PCR过程中我们能用引物扩增出预计IRI基因额大小片段，但是许多的测序结果不是，只有少数PCR扩增产物在后续产物中测序后进行分析发现与IRI基因相似性高（B2、B13、B15、B19、B25、W5、

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201*-1、W6-19191）。

分析上述结果，有以下几点原因：(1)重结晶抑制蛋白IRI基因是一个多基因家族，即使是同一个品种也会有多个IRI基因；（2）由于设计的引物是兼并引物，在PCR过程中与目的DNA的结合性不紧密而结合到别的片段上，扩增出片段，而这些扩增的片段可能在我们正需要的700-1000bp之间，也可能不在；（3）多对引物组合，不同的引物组合得到进行PCR扩增，得到不同的结果。

4.3测序结果的DNA多序列比多和氨基酸序列比对分析

经过NCBIBlast：网站对测序结果的基因比对，去除掉与IRI相似性极低的序列，最终筛选出编号为B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21共8个序列可以使用。这些获得的IRI基因编号对应的植物品种分别为：B2-沙生冰草、B15-簇生麦草、B24-布顿大麦草、B25-支药大麦草、W15-单芒山羊草、W17-高大山羊草、W21-拟斯卑尔脱山羊草。

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B2a.seqB2b.seqB15c.seqB24.seqB25.seqW15.seqW17.seqW21.seqATGGCGCCGAAATGCTGGCTGCTGCTCCACTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCGGCGGCGAGCGCTACGTCGTGCCATGCTGACGACCTCCACGCGCTGCAGGGCTTCGCCGGGAATCTCAGT...........ATGCGGGCTGCTACTCCTGTTCT.GGCGTTCCTCTTGCCTGTGGCAAGCGCGACGTCATGTCACGCTGATGACCTCCATGAGCTGCGGGGCTTCGCTGGGAAGCTCACA...ATGGCGAAATGCGGGCTGCTGCTCCACTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCGGCGGCGAGCGCTACGTCGTGCCATGCTGACGACCTCCTCGCGCTGCAGGGCTTCGCCGGGAATCTTAGTATGGCGCCAAAATGCTGGCTGATGCTCCTCTTCTTGGTGTTTCTCCTGCCGGCGACGAGCGCGAGGTCGTGCCACGCCGACGACCTCCGTGCACTGCGGGACTTCGCCCGGAACCTCACT...ATGGCGAAATGCTGGCTGCTGCTCCTGTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCAGCGGCACGTGCAACGTCATGCCACCCCGATGACCTCCGCGCGCTACGGGGCTCTGCCGGGAACCTTAGT...ATGGCGAAATGCTGGCTGGTGCTCCTCTGCTTGGTGTTCCTCCTGCTGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCTGCACTCTGCGGGACTTTGCCCGGAACCTCACC...ATGGCGAAATGCGGGCTGGTGCTCCTCTGCTTGGTGTTCCTCCTGCTGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCTGCACTCTGCGGGACTTTGCCCGGAACCTCACC...............GGGCTGATGCTCCTCTTCTTGGTGTTTCTCCTGCCGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCCACGCACTGCGGGAATTCGCCCGGAACCTCACC11111111B2a.seqB2b.seqB15c.seqB24.seqB25.seqGGTGGCGGCGTGCTCCTACGCGCTGTGTGGTCCGGCGCCTCGTGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGAGCTGCGACAGCACAAGTGGACGCGTCACGGCGCTTTGGCTCACCGGGCGCAGCCTTGGCGGTGGCGTGCTTCTCCGCGCCGCGTGGTCTGGCACTTCATGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGGGTTGTGACGGCGCAAGTGGACGGGTCACCGTGTTGCGGCTCCCAGGGTGCGGCCTTGGTGGCGGCGTGCTCCTACGCGATGTGTGGTCCGGCGCCTCGTGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGAGCTGCGACGGCACAAGTGGACGCGTCACGGTGCTTTGGCTCCCCGGGCGCAGCCTTGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGGACATCGTGTTGCAGATGGGAAGGTGTGGGCTGCAACGGCGCAAGTGGACGCGTCACAACGCTGCGGCTTCCCGGCCGCGGCCTTGGTAGGGCTGTCCTCCTCCGTGCTGCGTGGTCCGATGCCTCGTGCTGAGGCTGGGAAGGTGTGGGCTGCCATCGTGCTAGTGGCCGCGTCACGTCCCTGCGGCTCCCTGGACACGGCCTT22222W15.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGAACCACGTGTTGTGGCTGGGAAGGTGTGAACTGCGACGGCGTAAGTGGACGCGTCACGGCGCTGCGGCTCCCCGGGCGCGGCCTTW17.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGAACCACGTGTTGTGGCTGGGAAGGTGTGAACTGCGACGGCGTAAGTGGACGCGTCACGGCGCTGCGGCTCCCCGGGCGCGGCCTTW21.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGCGCAGCGTGGTCCGGCACCTGGTGTTGCAGATGGGAAGGTGTGGGCTGCGACGGCGGAAGTGGACGCGTCACAACGCTGCGGCTTCCCGGACGCGGCCTTB2a.seqGCGGGGCCCATCCCAGGAGCTTCCTTGGTGGGCCTCACGCAACTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAAACTAATCGGCAACATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCB2b.seqACTGGACCCATCCCAGGAGCATCCTTTGCGGGCCTGGTGCAGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAGCAACAGATTGGTCAGCACCATCCCTTTGTGGATCGGTGAGCTTCAACACCTTTGCB15c.seqGCGGGGCCCATCCCAGGAGCCTCCTTGGTGGGCCTCACGCAACTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAAACTAATCGGCAACATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCB24.seqGCAGGACCCATCGCAGGAGCATCCTTGGCGGGCTTAGCGTGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGGCTGATCGGCACAATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTB25.seqGCGGGGGCCATCCCAAGAGCATCCTTGGCAGGCCTCGCACGGTTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGGTTGGCACCATCCCATCGTGGATTGGCCAGCTTGATCACCTTTGCW15.seqGCAGGACCCATTGCAGGAGCATCCTTGGCAGGCCTGGCATGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACCATTCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGACCACCTTCGTW17.seqGCAGGACCCATTGCAGGAGCATCCTTGGCAGGCCTGGCATGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACCATTCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGACCACCTTCGTW21.seqGCAGGACCCATCGCTGGAGCATCCTTGGCGGGCTTGGCGCGGCTAGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACATTCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTB2a.seqTACTTGGATCTCTCCGATAATTCATTGGAAGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACGGCTTAAGGGTCTCGTTGCTGCTGGACGTTCAGTGGGTATGACATTCACTAACATGCCATTGTATB2b.seqTACTTGGATCTCTCTGATAATCCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCAGCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCGTTCACTAATATGCCATCGTATB15c.seqTACTTGGATCTCTCCGATAATTCATTGGAAGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACGGCTTAAGGGTCTCATTGCTGCTGGTCGTTCAGTGGGTATGACATTCACTAACATGCCATTGTATB24.seqTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTGATACGGTTCAAGGACATCACCAGCGCTGGTCGCTCATTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATB25.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACAGCTCAAGGGCCTAGTCATCGCTGGTCCTTCATCGGGTATGACTTTTACTAGCATGCCTTTGTATW15.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCGCCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATW17.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCGCCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATW21.seqTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTGATACGGTTCAAGGACATCACCATCGCTGGTCGCTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTATATB2a.seqGAGAAGCATAACCGAAGAACACTCCAAC...AACAACAACCAAATATCATATCCGGGACAAACAACAAAGTCAGATCTGGTAGAACCAATGTTGTATCTGGAAATGACAACACGGTCAAAB2b.seqGTGAAGCGTAACAGAAGAACACTCCAGG...AACAACAACCAAACACAATATCTGGGACCAACAATACTGTCAGATCTGGGAGAAACAATGTTGTTGCCGGGAACGACAACACTGTCATAB15c.seqGTGAAGCGTAACCGAAGAACACTCCAAC...AACAACAACCAAGTATCATATCCGGGACAAACAACAAAGTCAGATCTGGTAGAACCAATGTTGTATCTGGAAATGACAACACGGTCATAB24.seqGTGAAGCGTAACAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACGATATCTGGGACCAACAATAGCGTCAGATCTGGGAGAACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAB25.seqGGGAAGCGTAACAAAAGAACGCTTGACG......AACAACCAAATACAATATCTGGGAGTAACAACACCGTCAAATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAATACTGTCATAW15.seqGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCCACCAAATACGATATCAGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTAGGAATGACAACACTGTCATAW17.seqGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACGATATCAGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAW21.seqGTGAAGAGTAACAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACAATATCTGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAB2a.seqTCTGGAAACAACAACACTGTGGCTGGGAGCAACAATACCATCACAACTGGGAGCGACAATACCGTAGTAGGTAGCAACCATGTCGTATCTGGGACCAAACATATCGTAACTGACAACAACB2b.seqTCCGGCGACAACAACAATGTGTCTGGGAGCAACAACACTATCGTAACGGGGAGCGACAATACCGTAGTTGGTAGCAACCATGTTGTATCTGGGAACAAACATGTCGTAACTGACAACAACB15c.seqTCTGGAAACAACAACACTGTGGCTGGGAGCAACAATACCATCACAACTGGGAGCGACAATACCGTAGTAGGTAGCAACCATGTCGTATCTAGGACCAAACATATCGTAACTGACAACAACB24.seqTCCGGGGACAACAACAATGTGTCCGGGAGTAACAACACTATCGTTACCGGTAGCGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAACATGTTGTAACTGACAACAACB25.seqTCCGGGAACTACAACAATGTGGCTGGGAGCAACAACACTATCGTAACCGGGAGCGATAATACTGTAACTGGTAGCAACCATGTCGTATCTGGGGACAAACATATCGTAACTGACAACAACW15.seqTCTGGTAACAACAACAGTGTGTCAGGGAGTAACAACACTATCATAACCGTTAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCA.CCATGTCGTATCTGGGAACAAGCATGTCATAACTGACAACAACW17.seqTCTGGGAACAACAACAGTGTGTCAGGGAGTAACAACACTATCATAACCGGGAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAGCATGTCATAACTGACAACAACW21.seqTCCGGGAACAACAACAATGTGTCCGGGAGTAACAACACTATCGTAACCGGTAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAACATGTCGTAACTGACAACAACB2a.seqAATGTTGTTTCCGGGATTGACAATAATGTATCCGGCAGCTTCCACACCGTATCCGGGAGTCACAATACCATATCCGGGAGCAACAATACCGTATCAGGGAGCAACCATATTGTGTCTGGGB2b.seqAATGTCGTATCCGGAGACGACAATACTGTATCCGGGAGCTTCCATACCGTATCTGGGAGCCACAACACCGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGGACCAACCATGTCGTCTCTGGGB15c.seqAATGTTGTTTTCGGGATTGACAATAATGTATCCGGCAGCTTCCACACCGTATCCGGGAGTCACAATACCATATCCGGGAGCAACAATACCGTATCAGGGAGCAACCATATTGTGTCTGGGB24.seqAATGCCGTATCCGGAAATGACAATAATGTATCCGGGAGTTTCCATACCGTATCCGGGAGCCGCAT.ACTGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCACGTCGTGTCTGG.B25.seqAATGTCGTATCCGGAAATGACAATAATGTATCCGGAAGCTTCCATACCGTATCCGAGAGCAAGAATATTGTATCTGGGAGCAACAACACTGTATCTGGGAGCAACCATGTTGTATCCGGGW15.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCTGG.AGCTTCCATACGGTATCCGGGAGCCTCAATACA.TATCTGGGAGCAACAT.ACCGTATCTGGCAGCAT.CATGTCGTGTCTGGGW17.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCCGGGAGCTTCCATACGGTATCCGGGAGCCGCAATACAGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCATGTCGTGTCTGGGW21.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCCGGGAGCTTCCATACCGTATCCGGGAGCCGCAATACTGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCACGTCGTGTCTGGGB2a.seqAGCAACAAAGTCGTGACGGGAGGTTAA...B2b.seqAGCAACAAAGTCG...TAGGAGATGAATGAB15c.seqAAGCAACAAGTCGTGACGGGAAGTTAA...B24.seqAGCAACAAAGTCGTAACAG.AGATGAATGAB25.seqAGCAACAAAGTCG...TAGGACATGCATGAW15.seqAGCAACAAAGTCG.AACAG.AAATGAATGAW17.seqAGCAACAAAGTCGTAACAGGAGATGAATGAW21.seqAGCAACAAAGTCGTAACAGGAGATGAATGA图4.2DNA序列比对图（B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21）

在获得并分析的IRI基因中，DNA序列最短的为849bp，最长为864bp，片段在

222333333334444444455565555777777778888888888888888

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700-1000bp区间内，其中B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25编码的氨基酸总数分别为287、283、286、288、284、285、288、284。图4.2中为所获得并能分析的IRI基因，图中蓝黑色背景的碱基为8基因完全共有的区段片段，我们可以清晰到看到这些IRI的DNA片段共有区段多，相似性高；白色背景中的黑点表示在DNA序列比对中，此处不具有共有的碱基，其它背景颜色表示部分DNA共有碱基。

B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQMAPKCWLLLHFLAFLLPAASATSCHADDLHALQGFAGNLSGGGVLLRAVWSGASCCGWEG....MRAATPVLAFLLPVASATSCHADDLHELRGFAGKLTGGGVLLRAAWSGTSCCGWEG.MAKCGLLLHFLAFLLPAASATSCHADDLLALQGFAGNLSGGGVLLRDVWSGASCCGWEGMAPKCWLMLLFLVFLLPATSARSCHADDLRALRDFARNLTGGGVILRAAWSGTSCCRWEG.MAKCWLLLLFLAFLLPAARATSCHPDDLRALRGSAGNLSGRAVLLRAAWS.DASCGWEG.MAKCWLVLLCLVFLLLATSATSCHADDLCTLRDFARNLTGGGVILRAAWSGTTCCGWEG.MAKCGLVLLCLVFLLLATSATSCHADDLCTLRDFARNLTGGGVILRAAWSGTTCCGWEG.....GLMLLFLVFLLPATSATSCHADDLHALREFARNLTGGGVILRAAWSGTWCCRWEG6056596058595955B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQVSCDSTSGRVTALWLTGRSLAGPIPGASLVGLTQLEELNLANNKLIGNIPSWIGELDHLCVGCDGASGRVTVLRLPGCGLTGPIPGASFAGLVQLEELNLASNRLVSTIPLWIGELQHLCVSCDGTSGRVTVLWLPGRSLAGPIPGASLVGLTQLEELNLANNKLIGNIPSWIGELDHLCVGCNGASGRVTTLRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELEHLRVGCHRASGRVTSLRLPGHGLAGAIPRASLAGLARLEELNLANNRLVGTIPSWIGQLDHLCVNCDGVSGRVTALRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELDHLRVNCDGVSGRVTALRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELDHLRVGCDGGSGRVTTLRLPGRGLAGPIAGASLAGLARLEELNLANNRLIGTFPSWIGELEHLR1201*61191201*8119119115B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQYLDLSDNSLEGEVPKSLLRLKGLVAAGRSVGMTFTNMPLYEKHNRRTLQQQQ.PNIISGTYLDLSDNPLIGEVPKSLIRFKGISIAGRSLGKAFTNMPSYVKRNRRTLQEQQ.PNTISGTYLDLSDNSLEGEVPKSLLRLKGLIAAGRSVGMTFTNMPLYVKRNRRTLQQQQ.PSIISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKDITSAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPQPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLLQLKGLVIAGPSSGMTFTSMPLYGKRNKRTLDEQ..PNTISGSYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKGIAIAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPPPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKGIAIAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPQPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKDITIAGRSLGKAFTNMPLYVKSNRRTLQQQPQPNTISGT179175178180176179179175B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.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.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQNVVSGIDNNVSGSFHTVSGSHNTISGSNNTVSGSNHIVSGSNKVVTGG.NVVSGDDNTVSGSFHTVSGSHNTVSGSNNTVSGTNHVVSGSNKVVGDE.NVVFGIDNNVSGSFHTVSGSHNTISGSNNTVSGSNHIVSGKQQVVTGS.NAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRILYLGATIPYLEATTSCLEQQSRNRDE.NVVSGNDNNVSGSFHTVSESKNIVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVGHA.PYPETTIMYLELPYGIREPQYIS..GSNIPYLAASCRVWEQQSRTEMN.NAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRNTVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVTGDENAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRNTVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVTGDE287283286288284285288284

图4.3氨基酸序列比对图（B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21），图中下划线表示信号肽，向上的箭头表示半胱氨酸残基，水平向右的箭头表示LRR（亮氨酸酸富集区），水平双

向箭头代表NxVxxG/NxVxxG区。

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由于DNA的序列比对只能说明基因在碱基上相似性等相关问题，而基因的功能是通过蛋白表达表现出来的，而且在DNA序列中，经常会出现碱基的插入或者缺失导致移码突变，或者由于碱基突变但不一定引起氨基酸的改变等现象，所以我们我们将DNA翻译成氨基酸，从氨基酸层面上对所获得8个基因进行分析，同时结合DNA序列和氨基酸序列进行分析。

图4.3氨基酸比对图中，横线下划线处为8个IRI基因氨基酸的信号肽区域，从图中可以看出8个IRI基因氨基酸的的信号肽并非完全相同，只是部分的氨基酸相同。真核细胞N末端的信号肽位，一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电信号肽的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔．而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除，这些信号肽的不同将引起其表达过程中的差异。

半胱氨酸残基在蛋白质折叠过程中起着重要作用。偶数的半胱氨酸残基可以两两形成二硫键，二硫键能使蛋白折叠更加紧密，而奇数的半胱氨酸残基则会多出一个半胱氨酸残基，对蛋白折叠牢固产生影响[37]。除了编号为B25基因的氨基酸有三个半胱氨酸残基外，其余的7个IRI基因均有四个半胱氨酸残基（图4.3）,该半胱氨酸的改变可能B25植物的抗寒能力，但是需要要后续的实验研究进行验证。

和其它已经发现的重结晶抑制蛋白一样，我们在我们所获得的8个基因中也含有亮氨酸富集区（LLR）。图4.3中水平右向箭头起向右区域可以清晰看到多个L的重复。

图4.1中可以看到在DNA序列比对上W15和B24的C末端和其它6个基因的相似性和重复性非常高，而在图4.2中在红色矩形框内，发现W15和B24编码的氨基酸序列和其它6个基因基本上没有相似性，这样的原因可能是由于碱基插入或缺失造成，导致移码突变，后续氨基酸的编码全部错位，这种结构变化可能导致整个IRI蛋白的失活，或者功能降低。

4.4IRI的进化分析

本研究将所获得的IRI基因和从NCBI搜索的多个小麦野生近缘植物IRI基因汇总在一起，进行系统进化分析。图4.4和图4.5是基因进化分析的两种不同表现形式，图4.4无根树形式可以直观的看到基因的分类和亲缘关系的远近，而图4.5有根树亲缘关系的远近更形象的展示出来。其中如图4.4中可以大致分为六个部分:EU887261.1,AK360260.1,B25,AY968588.1;AK360446.1;FJ663038.1和EU680848.1;B2a和B15c;B2b;

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AK360446.1;W17。

由分子进化树可以看出，AK360260.1（大麦草）、EU887261.1（大麦草）和B25（支药大麦草）亲缘关系最近；B2A（沙生冰草）和B15（簇生麦草）亲缘关系最近；B2B（沙生冰草）与其它物种的情缘关系较远；B24（布顿大麦草）和W21（拟斯卑尔脱山羊草），W15（单芒山羊草）与W17（高大山羊草）在IRI基因分类上较近。

对于从同一材料中克隆出的IRI基因（B2a和B2b来自同一植物）亲缘关系应该是最近的，但B2a和B15c亲缘关系比B2a和B2b更近，说明IRI基因家族存在较为丰富的变异，推测可能是在植物长期进化过程中不断适应低温变化而调整自身基因结构从而适应低温环境的原因。

AK360260.1Translation.seqEU887261.1Translation.seqB25Translation.seqAY968588.1Translation.seqAK360446.1Translation.seqEU680848.1Translation.seqFJ663038.1Translation.seqB2aTranslation.seqB15cTranslation.seqB2bTranslation.seqB24Translation.seqW21Translation.seqW15Translation.seqW17Translation.seq0.05

图4.4IRI基因进化分析-有根树

小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定以及纯化

AK360446.1Translation.seqFJ663038.1Translation.seqEU680848.1Translation.seqAY968588.1Translation.seqB2aTranslation.seqB15cTranslation.seqB25Translation.seqEU887261.1Translation.seqAK360260.1Translation.seqB2bTranslation.seqW17Translation.seqW21Translation.seqB24Translation.seqW15Translation.seq0.05图4.5IRI基因进化分析-无根树

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5．讨论

本文利用同源克隆的思维方法，根据NCBI核酸数据库中已有的IRI序列的信息，设计简并引物对小麦野生近缘属种IRI基因进行分离，以分析不同小麦族材料间IRI基因的结构变化和系统进化关系。从最初的9对引物对90个小麦野生近缘材料的IRI基因进行扩增，最终我们得到了编号为B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25的8个IRI基因，而8个基因分属7个材料（其中B2A和B2B来源于同意材料）。

在进行PCR的过程中，对90个植物品种中我们用了多对引物组合进行扩增，同时还分别运用了梯度PCR进行筛选最适的引物退火温度、小套大的嵌套PCR和降落PCR（TouchdownPCR）去除非特异扩增。TouchdownPCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到—Touchdown‖退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法。即便使用了多种PCR方法，在PCR产物凝胶电泳中我们依然发现了有多个条带在700-1000bp。

实验中中得到的B2A和B2B说明了我们进行克隆的IRI基因并不只以单基因形式存在，而是多基因家族。B2A、B2B编码的氨基酸总数分别为287、283，在长度上相差12bp，在这琼脂糖凝胶电泳中基本上看不出差异，这表明在实验过程中，即使我们获得了阳性克隆鉴定的目的大小片段，但在测序中，选取多个阳性克隆进行测序鉴定是必要的。

本研究所得所有IRI基因和已知基因具有很多保守区域，如信号肽、半胱氨酸、LRR区，而就多数重结晶抑制蛋白IRI而言，它有其自身特有的的重复IRI区(NxVxxG)和(NxVxG)，x表示在N和V之间，或则V和G之间的其它氨基酸（除了N、V、G三个氨基酸外）。这个特征区作为我们识别IRI的主要依据[38,39]，而图4.2中显示了我们所获得的IRI基因之间的重复IRI区(NxVxxG)和(NxVxG)，它们都位于整个基因长度中间偏后区域，而且这些区域的重复不是直接的串联式的重复，而是在这些重复区间内插入了别的氨基酸。对于重复IRI区(NxVxxG)和(NxVxG)，邓顺阳等[40]在对黑麦草抗冻蛋白基因的研究中提到对IRI基因进行序列分析时，预测其有两个冰晶结合面a面和b面，每面的模体“xxNxVxG”可能与亲水性有关，都以额氨酸(V)为冰晶结合中心。预测的蛋白质结构与大部分抗冻蛋白一样，含有类似的β-螺旋结构，这些结构可能与冰晶结合的表面和抑制重结晶有关[41]。

本研究所获得的IRI基因除了具有IRI特有的特征区NxVxG/NxVxxG之外，还有其它共有的特征区域信号肽、偶数个半胱氨酸C（除B25外因为碱基突变导致有三个C外，其余已获得的基因均有4个半胱氨酸C）、亮氨酸重复去LLR，这些共有的特征区

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为一般功能基因所共有，但不同功能的基因其结构区内部序列不同。测序结果中发现的W15和B24编码的氨基酸序列和其它6个基因相似性很低，导致后续基因编码错乱，可能直接影响这两个IRI基因编码的蛋白结构，推测可能影响重结晶抑制蛋白的冰结晶抑制效应等相关效应。

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致谢

本研究论文在郭志富老师悉心指导下完成。导师在设计的选题试验设计及研究内容方面都给我以严格的要求和关键性的指导，设计完成后给以详细的审阅和修改。导师严谨的治学态度、勤奋忘我的工作精神、扎实深厚的专业知识及热情真挚的修养品行深深地感染着我，他言传身教使我在学术思想、工作作风、为人处世等诸多方面都终生受益。值此论文答辩之际，特向我的恩师致以崇高的敬意和衷心的感谢。此外，还有生物技术教研室140室给我指导与教诲的钟鸣、李浩戈、陈丽静、马慧、林景卫老师，郭老师课题组的白丽萍老师、农学院的衣莹老师，以及帮我修改英文文章的冯玉龙院长，从法国归来的安迎锋老师，向老师们表示我最诚挚的谢意。

实验过程中我还要感谢那些帮助过我或者我帮助过的师兄师姐，学弟学妹，因为有你们帮助，我能在一年内把研究生阶段能做的实验快速学会，因为我能为实验室师兄师姐或学弟学妹们提供实验帮助，我的实验技能得以更加娴熟。谢谢去年研三的黄国涛、齐欣、单存海、杨锋师兄、马爽、赵莉师姐；谢谢今年研三的闫文文、殷宇、陈啄、钟声、刘彦飞、曹珊、李丽丽、孙春遇、葛菱、刘晓宇、金迪；谢谢10级研究生姜跃，在我201*年6月时第一次进入实验室做实验，还有10级研究生张亚琳、彭丹、李丽丽、祝红艳、刘新建、王丽、殷晓娟；当然不能忘了07级本科生杜慧、李同同、党晓璇，还有马超、马明南、孟思纹我们这些紧紧围绕在郭老师周围的亲们；和我一样08级的陈萍、严菊、王硕、刘畅、袁，09级学妹王静宜。因为你们，我在实验室得以专业知识、实验技能快速提升，能参加各种生物学相关的学术讲座和生物公司的技能培训讲座，能发表英文文章，能去北京大学生命科学学院实习，能在沈阳农业大学做了自己大学阶段最有意义的事。因为你们，我的大学生活、实验室生活过得丰富多彩，过得充实，因为你们，我在生物找回了自己的兴趣。感谢所有关心、帮助过我的同学们、朋友们!愿他们学业有成，工作顺利，家庭幸福！

最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。

在此论文完成、即将离开校园之际，谨向所有关心、支持、帮助我的各位老师、同学表示最诚挚的感谢!

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沈阳农业大学本科毕业设计承诺书

设计题目完成人姓名小麦近缘属种IRI基因的分离、鉴定及进化分析张富专业生物技术指导教师姓名郭志富职称讲师本毕业设计的创新点：1.本研究以小麦野生近缘属种为研究材料，对植物中的IRI抗冻基因进行分离。以材料的特殊性状为切入点进行系统的功能研究。2.本研究获得的8个IRI基因与已知相关基因进行比对分析发现其均为新的变异类型，在抗冻功能上可能有不同表现，为更好的理解不同IRI基因分分子间的抗冻分子机制提供了新的参考。承诺内容：本毕业设计是本人在导师郭志富老师指导下独立完成的，没有抄袭他人成果，对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明，完成人签名：指导教师签名：年月日年月日

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